ラベル

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12746 (2022) この記事を引用

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ここでは、トータル ホログラフィック キャラクタリゼーション (THC) を、細胞生存率を正確に識別する効率的で自動化されたラベル不要の方法として紹介します。 THC は、光散乱のローレンツ・ミー理論を使用して個々の粒子のサイズと屈折率を決定する単一粒子特性評価技術です。 細胞生存率の評価は生物製剤の製造を含む多くの用途において課題ですが、従来のアプローチには、色素による信頼性の低い標識や手動で細胞を計数する時間のかかる方法が含まれることがよくあります。 この研究では、さまざまな濃度のイソプロパノールの存在下での出芽酵母の生存率を時間の関数として測定しました。 すべての THC 測定は、希釈やラベルの追加を行わずに、サンプルのネイティブ環境で実行されました。 ホログラフィック測定は、平面波照明を備えた 40\(\times\) 対物レンズを使用したインライン ホログラフィック顕微鏡で行われました。 THC を使用した結果と、トリパン ブルー色素で識別された生細胞と死細胞の手動計数を比較しました。 私たちの発見は、THCが個々の細胞の屈折率によって生きている酵母細胞と死んだ酵母細胞を効果的に区別できることを示しています。

酵母細胞、特に Saccharomyces cerevisiae の使用は、細胞ベースの実験からタンパク質製造まで、産業界と学術界の両方で広く普及しています 1,2,3。 たとえば、医学研究では、酵母は癌に関連する遺伝子変異を研究するためのモデル生物として機能します4、5、6。 バイオ医薬品の研究と製造では、酵母細胞が目的のタンパク質を生産するためのミニ工場として使用されます7、8、9。 さらに、最もよく知られている用途の 1 つとして、酵母はビール、ワイン、パン製造を最適化するために消費者製品の研究と製造に使用されています10、11、12、13。

細胞生存率は、これらのアプリケーションの多くで重要な重要なパラメーターです14。 酵母の生存率を測定する多くの方法が存在しますが、ほとんどの方法には 1 つの制限があります。それは、細胞を色素で染色する必要があるということです。 トリパンブルー (TB) 排除アッセイなどの色素ベースの方法は、正常な細胞膜が色素に対して不透過性であることに依存しますが、死んだ細胞または損傷した細胞の膜は色素が細胞内に拡散することを可能にします 15。 この方法は便利ですが、通常は面倒なサンプル前処理と手動による細胞計数が必要になります。 手動による細胞計数では統計量が低く、人的ミスが発生しやすくなります。 さらに、結核排除アッセイは、生存率を過大評価し、生存率が 70% ～ 80% 未満の特定の細胞サンプルについては信頼できないことが示されています 16、17、18。

さらに、色素ベースの染色生存率測定では、色素が細胞または別の実験変数と意図しない形で相互作用する危険性があります。 一例として、トリパンブルーは細胞と悪影響を及ぼし、多くの場合細胞を破壊するため、生存率測定の信頼性が低下することが示されています19。 ラベルベースの生存率アッセイの欠点はよく知られていますが、ラベルを使用しない代替法はほとんど存在しません 20。

この研究では、Total Holographic Characterization® (THC) を使用して酵母の生存率を確実に測定するラベルフリーの自動技術を導入します。 THC は、ホログラフィック ビデオ顕微鏡法に基づいた技術で、懸濁液中の目に見えない粒子を検出、計数、特性評価するために開発されました21。 ここでは、THC を実装し、ホログラフィック顕微鏡法とマイクロ流体サンプル処理を組み合わせて粒子サイズと屈折率の正確な測定を提供する xSight を使用して酵母の生存率を評価しました。 使い捨てマイクロ流体サンプルチップの使用により、サンプル間の相互汚染がなく、洗浄も必要ありません。 各測定は自動化されており、完了までに約 15 分かかります。